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            1. 非洲豬瘟病毒的實驗室診斷

              2019-01-10

              1、非洲豬瘟病毒簡介

               

              非洲豬瘟(ASF)的病原是單一的、有囊膜的、存在于細胞質內的雙鏈DNA 病毒,是非洲豬瘟病毒科的唯一成員。目前為止,通過對已知所有的 ASF 病毒毒株進行遺傳特征分析,已經證實了 23 個具有多個亞組的地理相關基因型,這說明了 ASF 流行病學的復雜性?;蛐褪歉鶕幋a VP-72 蛋白的單一基因序列確定的,蛋白質 (VP-72) 中片段變異性的反映,主要用于系統發育和分子流行病學研究 ( 例如識別暴發的來源 )。就目前所知,與毒力和其他病毒特性無關。

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              家養豬感染ASF后,發病過程短,致死率往往接近90-100%,臨床表現為發熱,嘔吐,皮膚發紺,淋巴結,腎,胃腸粘膜明顯出血等癥狀。


              2、非洲豬瘟的實驗室診斷方法

               

              由于非洲豬瘟缺乏預防用疫苗,為防止疫病的傳播,就需要實施嚴格的衛生和生物安全控制措施,而這就依賴于疫病的快速、可靠的早期診斷。

               

              (1)紅細胞吸附試驗(HA)

              ASFV 的紅細胞吸附試驗是該病毒特有的檢測技術,其他豬源病毒在白細胞培養物中不存在紅細胞吸附特性。當病毒在這些培養物中復制時,多數ASFV 毒株會產生紅細胞吸附反應(HAD),在感染的白細胞周圍吸附豬紅細胞形成 “玫瑰花環”。但是在沒有發生紅細胞吸附反應的時候出現細胞病變(CPE),需采用FAT或PCR方法輔助診斷。

               

              (2)PCR檢測非洲豬瘟病毒基因組

               PCR 已成功應用于豬樣品(血液、器官等)和蜱中ASFV 基因組的檢測。病毒DNA 片段通過PCR 擴增獲得足以檢測的量,從而實現檢測。所有經過驗證的PCR 技術均可以在臨床癥狀出現前實現檢測。PCR 能在樣品到達實驗室數小時內,完成ASF 的診斷。PCR 是可以代替病毒分離鑒定的一種靈敏、特異、快速的ASFV 檢測技術。同時,相比于抗原檢測技術,如酶聯免疫吸附試驗(ELISA)和直接熒光抗體測試(FAT),具有更高的敏感性和特異性。

               

              (3)直接熒光抗體法對非洲豬瘟抗原的檢測(FAT法)

              FAT 可用于檢測豬組織中的 ASFV 抗原。檢測原理是通過顯微觀察感染臟器涂片或薄層冷凍切片上的病毒抗原實現的。使用異硫氰酸熒光素(FITC)結合的特異性抗體檢測細胞內抗原。FAT 也可用于檢測未觀察到 HAD 的白細胞培養物中的 ASFV 抗原,因此可以鑒定不產生 HAD 反應的 ASFV 毒株。FAT 還可用于鑒別CPE 是由 ASFV 感染導致的,還是由其他病毒感染或者導致的接種的細胞毒性導致的。該方法也是對特急性和急性 ASF 病例的高度敏感的檢測技術,且可以非??焖俚耐瓿蓹z測。雖然 FAT 是高效的檢測技術,但目前已被 PCR 逐步取代,所需試劑也不再廣泛使用。然而在亞急性和慢性型感染中,FAT 的敏感性明顯降低(40%)。

               

              (4)ELISA檢測非洲豬瘟抗原

              也可以使用 ELISA 檢測病毒抗原,其成本比 PCR 更為低廉,并且可在沒有特殊的實驗室儀器設備的條件下,短時間內對樣品的大規模篩查。然而,與 FAT 相似,對于亞急性和慢性病例,抗原ELISA 的敏感性明顯較低。同時,現地樣品通常狀態不佳,因此也降低了檢測的敏感性。因此建議抗原ELISA(或其他ELISA)主要用于 “群體”檢測,并輔助以其他病毒學和血清學檢測。

               

              (5)血清學抗體檢測

              對于檢測ASF 抗體,推薦使用ELISA 篩查抗體陽性樣品,并采取免疫印跡試驗(IB)或間接熒光抗體(IFA)試驗進行確認。此外,間接免疫過氧化物酶的抗體檢測技術也可用作豬血清和組織滲出物中ASF 抗體檢測的替代試驗。該技術也適用于大量樣品的檢測,而無需昂貴的熒光顯微鏡設備,且敏感性較高。但是此外, ASFV 抗體在感染早期即可出現,并持續數年。然而,在特急性和急性感染中,豬通常在抗體轉為陽性前已死亡。因此,在疫病暴發的早期階段,建議采集樣品檢測病毒DNA。


              總結:現有ASFV檢測技術最常用的是PCR和ELISA抗體檢測,但是這兩項技術需要耗時在3h 以上,且必須在規定的實驗室內依賴專業的人員完成,給家豬的日常檢測、早期檢測、早期診斷帶來一定技術難度,ASFV的快速現場檢測將會是未來發展的一個重點。

               


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